Met celsystemen ingrijpen in C9orf72-genafwijking

Grootschalige studies naar de ziekte ALS suggereren dat genetische factoren van invloed zijn op het ziekteverloop. Dit geldt met name wanneer er sprake is van de C9orf72-genafwijking, de meest voorkomende ALS-mutatie (bij 8-10% van alle ALS-patiënten). Daarom is het belangrijk om inzicht te krijgen in de manier waarop genetische factoren de aanmaak van de C9orf72-genafwijking beïnvloeden. Dit gebeurt door de ontwikkeling van celsystemen.

Het onderzoek

In dit onderzoek richten we ons op de meest voorkomende genetische verandering in ALS-patiënten (gevonden in 8-10% van alle patiënten): een stukje van zes DNA bouwstenen. Nadat dit stukje zich tientallen tot meer dan honderd keer heeft herhaald, heeft dit zich genesteld in het gen C9orf72. Wanneer dit repeterende DNA-stukje wordt afgeschreven, leidt dat tot ongewenste RNA- en eiwitklonteringen in de motorneuronen van ALS-patiënten.

Doel van ons onderzoek is om nieuwe aangrijpingspunten te vinden om het afschrijven van dit repeterende blokje DNA in C9orf72 tegen te gaan. Hiertoe ontwikkelen we nieuwe celsystemen om te kunnen screenen naar eiwitten die betrokken zijn bij het afschrijfproces van repeterend DNA in ALS.

Update 30 juni 2019

Tijdens dit onderzoek hebben we ontdekt dat het niet makkelijk is om het afschrijven van het repeterende stukje ALS in celsystemen na te bootsen, noch om de grootte van de repeterende sequentie goed te bepalen. Na twee jaar van het onderzoek is de conclusie dat we langer dan verwacht nog bezig zijn om onze celsytemen te genereren, waarbij we (1) een nieuwe technologie ontwikkelen om het repeterende DNA in kaart te brengen en (2) de nieuwste inzichten gebruiken om deze goed afgeschreven te krijgen in celsystemen.

De verwachting is dat we in het derde jaar van het onderzoek zullen slagen om de celsystemen gereed te hebben en de screen uit te voeren. We gaan daarbij leren of er factoren bestaan die neuronen helpen om het ALS repeterende DNA stukje af te schrijven. Ook zullen we bestuderen of deze mogelijk als aangrijpingspunt kunnen dienen om te voorkomen dat neuronen deze ziekte-veroorzakende handeling kunnen uitvoeren.

Update 31 december 2019

In dit project richten we ons op de meest voorkomende genetische verandering in ALS patiënten (gevonden in 8-10% van alle patiënten): een stukje van zes DNA bouwstenen dat zich, 10-tallen tot meer dan honderd keer herhaald, genesteld heeft in het gen C9orf72. Wanneer dit repeterende DNA stukje wordt afgeschreven leidt dattot ongewenste RNA en eiwit klonteringen in de motorneuronen van ALS patiënten. Doel van ons onderzoek is om nieuwe aangrijpingspunten te vinden om het afschrijven van dit repeterende blokje DNA in C9orf72 tegen te gaan.

Hiertoe ontwikkelen we nieuwe celsystemen om te kunnen screenen naar eiwitten die betrokken zijn bij het afschrijfproces van repeterend DNA in ALS. Tijdens dit project hebben we ontdekt dat het niet makkelijk is om het afschrijven van het repeterende stukje ALS in celsystemen na te bootsen, noch om de grootte van de repeterende sequentie goed te bepalen. Stand van zaken na 2 jaar looptijd is dat we langer dan verwacht nog bezig zijn om onze celsytemen te genereren, waarbij we (1) een nieuwe technologie ontwikkelen om het repeterende DNA in kaart te brengen en (2) de nieuwste inzichten gebruiken om deze goed afgeschreven te krijgen in celsystemen. Op beide punten is de laatste tijd goede progressie geboekt. We hebben een geheel nieuwe aanpak ontwikkeld die goede mogelijkheden lijkt te bieden om het repeterende ALS DNA in kaart te brengen: dit gaan wij nu testen. Wat betreft de celsystemen: enige verdere karakterisatie is nog noodzakelijk, maar we denken er in geslaagd te zijn de celsystemen te creëren waarmee wij het afschrijven van het repeterende stukje ALS kunnen monitoren. Hiermee zullen we op korte termijn kunnen gaan screenen naar eiwitten die dit proces beïnvloeden. We gaan daarbij leren of er factoren bestaan die neuronen helpen om het ALS repeterende DNA stukje af te schrijven en we zullen bestuderen of deze mogelijk als aangrijpingspunt kunnen dienen om te voorkomen dat neuronen deze ziekteveroorzakende handeling kunnen uitvoeren.

Update 30 juni 2020

Tijdens dit project hebben we ontdekt dat het niet makkelijk is om het afschrijven van het repeterende stukje ALS in celsystemen na te bootsen, noch om de grootte van de repeterende sequentie goed te bepalen. Stand van zaken na 2,5 jaar looptijd is echter dat we nu beide aspecten onder controle hebben. We hebben een nieuwe technologie ontwikkeld om de grootte van het repeterende ALS DNA in C9orf72 in kaart te brengen. We zullen nu kijken of deze techniek ook gebruikt kan worden voor de genetische karakterisatie van repeterend DNA in ALS patiënten. Dankzij deze nieuwe techniek hebben we onze celsystemen kunnen karakteriseren en bevestiging gekregen dat we nu verschillende soorten celsystemen gereed hebben voor screening naar eiwitten die de afschrijving van repeterend ALS DNA beïnvloeden. Deze screens zullen op korte termijn plaatsvinden. We gaan daarbij leren of er factoren bestaan die neuronen helpen om het ALS repeterende DNA stukje af te schrijven. In vervolgonderzoek zullen we dan bestuderen of deze als aangrijpingspunt kunnen dienen om te voorkomen dat neuronen deze ziekte-veroorzakende handeling kunnen uitvoeren.

Update 31 december 2020

In dit project hebben we ons gericht op de meest voorkomende genetische verandering in ALS patiënten (gevonden in 8-10% van alle patiënten): een stukje van zes DNA bouwstenen dat zich, 10-tallen tot meer dan honderd keer herhaald, genesteld heeft in het gen C9orf72. Wanneer dit repeterende DNA stukje wordt afgeschreven leidt dat tot ongewenste RNA en eiwit klonteringen in de motorneuronen van ALS patiënten. Doel van ons onderzoek is om nieuwe aangrijpingspunten te vinden om het afschrijven van dit repeterende blokje DNA in C9orf72 tegen te gaan. Hiertoe ontwikkelen we nieuwe celsystemen om te kunnen screenen naar eiwitten die betrokken zijn bij het afschrijfproces van repeterend DNA in ALS. Tijdens dit project hebben we ontdekt dat het niet makkelijk is om het afschrijven van het repeterende stukje ALS in celsystemen na te bootsen, noch om de grootte van de repeterende sequentie goed te bepalen.
Aan het einde van de looptijd van dit project is de stand van zaken dat we nu de grootte van het repeterende ALS DNA in C9orf72 in kaart hebben kunnen brengen en bevestigd hebben dat deze voldoende groot is (65-70 repeats) om een zinvolle screen uit te voeren. De screen wordt nu met interne financiering uitgevoerd en afgerond, om te zoeken naar eiwitten die de afschrijving van repeterend ALS DNA beïnvloeden. Mocht we kandidaat factoren identificeren dan zal in vervolgonderzoek bestudeerd worden of deze als aangrijpingspunt van mogelijke therapie kunnen dienen.

Eindrapportage

Achtergrond:
In dit project hebben we ons gericht op de meest voorkomende genetische verandering in ALS patiënten (gevonden in 8-10% van alle patiënten): een stukje van zes DNA bouwstenen (G4C2) dat zich, 10-tallen tot meer dan honderd keer herhaald, genesteld heeft in het gen C9orf72. Wanneer dit repeterende DNA stukje wordt afgeschreven leidt dat tot ongewenste RNA en eiwit klonteringen in de motorneuronen van ALS patiënten.

Doelstelling:
Doel van ons onderzoek is om nieuwe aangrijpingspunten te vinden om het afschrijven van dit repeterende blokje DNA in C9orf72 tegen te gaan. Hiertoe wilden we nieuwe celsystemen ontwikkelen om te kunnen screenen naar eiwitten die betrokken zijn bij het afschrijfproces van repeterend DNA in ALS. De eiwitten geïdentificeerd in deze screen zouden dan kunnen dienen als aangrijpingspunt voor mogelijke nieuwe therapieën.

Resultaten:
Voor dit project wilden wij fluorescerende reporter genen inbouwen in cellijnen, telkens op dezelfde plek in het genoom. In de ene serie cellijnen zou het reporter gen niet het G4C2 repeterend DNA blokje bevatten (de controle cellijn), in de andere serie cellijnen juist wel (de test cellijn). In beide cellijnen zouden we vervolgens systematisch alle andere genen 1-voor-1 uitschakelen, om op zoek te gaan naar 1 of meer genen die wel een effect hebben op de fluorescentie (het aflezen van het reporter gen) van de test cellijn, maar niet op de fluorescentie van de controle cellijn. Deze genen zijn interessant om verder te bestuderen, omdat hun uitschakeling mogelijk helpend kan zijn voor ALS patiënten met G4C2 repeterend DNA in het gen C9orf72. We hebben hiertoe condities in het lab moeten ontwikkelen om (a) lang repeterend G4C2 te pakken te krijgen, (b) om deze stabiel in het lab te behouden (repeterend G4C2 breekt heel snel af), (c) om hun grootte goed te bepalen en (d) om de reporter genen sterk genoeg te maken dat het repeterend G4C2 ook daadwerkelijk wordt afgeschreven en leidt tot fluorescerende cellen. Al deze horden bleken niet triviaal maar zijn inmiddels overwonnen. We zijn erin geslaagd om de gewenste fluorescerende reporter genen te maken en in te bouwen in cellijnen, zodat we nu goed fluorescerende controle en test cellijnen hebben. De testcellijnen hebben een 65-70x repeterende ALS DNA blokje, wat voldoende groot is om een zinvolle screen uit te voeren.

Vervolgonderzoek:
Met interne financiering wordt momenteel de screen uitgevoerd. De data analyse moet uitwijzen of onze aanpak leidt tot de ontdekking van nieuwe eiwitten die de afschrijving van repeterend C9orf72 ALS DNA beïnvloeden. Mochten we dergelijke kandidaat factoren identificeren dan zal in vervolgonderzoek zeker bestudeerd worden of deze als aangrijpingspunt van mogelijke therapie kunnen dienen.

 

[projectnr. 2017-59]
Looptijd
3 jaar (2017 - 2020)
Begroting
€ 395.000,-